ПЦР - диагностика в режиме «реального времени»

Полимеразная цепная реакция (ПЦР, англ. — PCR — polymerase chain reaction) была открыта Кэри Б. Мюллисом в 1983 году. ПЦР — это метод, который позволяет найти в исследуемом клиническом материале небольшой участок генетической информации (ДНК/РНК) инфекционного возбудителя, многократно его размножить и выявить с помощью различных современных технологий. В настоящее время ПЦР является одним из высокочувствительных методов диагностики инфекционных заболеваний, который позволяет выявлять единичные вирусные частицы или бактериальные клетки. Преимущества метода ПЦР:

• Возможность выявлять самого возбудителя, а не антител к нему.

• Обладает высокой специфичностью, поскольку детектирует уникальный, характерный только для данного возбудителя фрагмент ДНК.

• Имеет высокую чувствительность по сравнению с известными методами диагностики.

• Автоматизирован.

• Позволяет проводить массовые исследования.

• Возможно выполнение анализов в течение 1 суток.

• Метод универсален, т.к. из одной пробы клинического материала можно

выполнить исследования на наличие возбудителей нескольких заболеваний.

ПЦР-лаборатория открыта в БУ «Президентский перинатальный центр» на базе КДЛ в 2012 году. В работе используем прибор для проведения ПЦР в режиме «реального времени» - Rotor-Gene Q («QIAGEN Hilden», Германия). Основные направления работы лаборатории в настоящее время, это -

1. Диагностика урогенитальных инфекций:

Качественная идентификация хламидий (Chlamydia trachomatis).
Качественная идентификация уреаплазмы (Ureaplasma urealyticum и Ureaplasma parvum).
Качественная идентификация микоплазмы (Mycoplasma hominis и Mycoplasma genitalium).
Качественная идентификация вирус простого герпеса 1 и 2 типов (HSV 1,2).
Качественная идентификация цитомегаловируса (CMV).
Качественная идентификация трихомониаза (Trichomonas vaginalis).
Качественная идентификация гонореи (Neisseria gonorrhoeae).
Количественное выявление кандидоза (CandidaCandida albicans, Candida glabrata, Candida сrusei).
"Флороценоз влагалища" - для исследования биоценоза урогенитального тракта у женщин (выявление Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae, Lactobacillus spp., общее количество бактерий). Материал для исследования - соскоб с боковых стенок влагалища, отделяемое задненижнего свода влагалища. Предполагаемый метод:
а). Позволяет выявлять трудно культивируемые анаэробные микроорганизмы (Atopobium vaginae, Gardnerella vaginalis).

б). Позволяет проводить комплексную оценку микроорганизмов - маркеров анаэробного дисбиоза (бактериального вагиноза) в количественном формате, определять соотношение между ними и делать заключение о состоянии влагалищного биотопа.

в). Позволяет за счет определения коэффициента соотношения между лактобактериями (количество ДНК Lactobacillus spр.) и общего количества бактерий (количество ДНК Bacteria) оценивать степень влагалищного дисбиоза.

г). Позволяет подобрать адекватную терапию и проводить мониторинг ее эффективности.

2. Диагностика вирусов папилломы человека (ВПЧ):

• Количественное выявление ВПЧ 16 и 18 типов.

• Выявление и количественное определение ДНК ВПЧ группы А9 (16, 31, 33, 35,52, 58 типы); ДНК ВПЧ группы А7 (18, 39, 45, 59 типы) и ДНК ВПЧ групп А5 и А6 (51, 56 типы) в клиническом материале методом ПЦР в режиме "реального времени".

3. Выявление мутаций (полиморфизма) в системе гемостаза:

• Лейденская мутация.

• Мутация протромбина G20210A.

• Мутация ингибитора активатора плазминогена - PAI-1.

• Мутация метилентетрагидрофтолатредуктазы MTHFR.

4. Выявление мутаций в гене ответственном за семейную форму рака молочной железы (РМЖ) и рака яичников (РЯ) методом ПЦР:

мутация -1 BRCA1,
мутация -2 BRCA1,
мутация -1 BRCA2.
5. Выявление и количественное определение ДНК в крови и слюне методом ПЦР c гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме "реального времени":

вируса Эпштейна-Барр (EBV),

вируса герпеса 6 типа (HHV6),

цитомегаловируса (СMV).

6. Выявление гена резус-фактора (RHD) в крови беременной резус-отрицательной женщины c 10-ой (эмбриологической) недели беременности набором «Tecт-RHD» методом ПЦР с детекцией в режиме «реального времени».

В ПЦР-лаборатории Президентского перинатального центра внедрён метод неинвазивной пренатальной диагностики «Тест-RHD» («ТестГен», Россия) для определения резус-фактора плода у резус-отрицательных женщин с целью выявления риска развития резус-конфликта и его обоснованной профилактики.

Что такое резус-конфликт и чем он грозит при вынашивании ребенка, лучше всего знают беременные женщины с отрицательным резус-фактором. Если у такой женщины резус-положительный партнер, то есть большая вероятность, что ребенок унаследует от отца положительный резус, и тогда возникнет тот самый резус-конфликт: в крови будущей мамы начнут вырабатываться антитела, отторгающие плод. По статистике, резус-конфликт развивается в 50% случаев, но профилактика иммуноглобулином назначается всем женщинам с отрицательным резусом, так как выяснить резус-фактор плода можно только хирургическим путем.

Для проведения анализа у беременной женщины с 16-ой (эмбриологической) недели беременности отбирают 10 мл венозной крови (в пробирку с антикоагулянтом ЭДТА). Фетальные клетки, т. е. клетки плода, обнаруживаются в крови беременной женщины, их количество возрастает с увеличением срока гестации, зависит от состояния плаценты и особенностей течения беременности.

ПЦР-исследование состоит из следующих этапов:

Экстракция (выделение) ДНК из исследуемых образцов.

Проведение амплификации с флуоресцентной детекцией продуктов амплификации в режиме «реального времени».

Регистрация и учёт результатов анализов.

Определение резус-фактора методом ПЦР в режиме «реального времени» заключается в обнаружении гена RHD плода, кодирующего D-антиген, в крови матери. Данный диагностический метод позволяет оптимизировать ведение пациенток с риском гемолитической болезни плода в БУ «Президентский перинатальный центр».